PRODUZIONE DI ANTICORPI MONOCLONALI RICOMBINANTI

VERSO L’HERPESVIRUS UMANO 8

Introduzione

L’Herpesvirus umano 8 (HHV-8) è un virus animale di tipo temperato, appartenente al genere RADINOVIRUS. La famiglia d’appartenenza è quella degli Herpesviridae, e in particolare è collocato all’interno della sottofamiglia gamma. Ad essa appartengono anche il virus Herpes saimiri (HVS), e il virus di Epstein-Barr (EBV).

 E’ costituito da un DNA bicatenario che può trovarsi in due conformazioni: lineare, caratteristica della fase litica o replicativa, e circolare o “episomiale”, caratteristica della fase latente. Nelle cellule infettate in vitro, si può passare dalla fase latente a quella litica mediante induzione con esteri del forbolo.

L’HHV-8 è stato studiato a partire da linee cellulari di linfomi in effusione primaria. Nelle prime, BC-1 e BC-2, coinfettate da HHV-8 e dal virus di Hepstein Barr contemporaneamente, il genoma virale è stato ritrovato nel nucleo in forma circolare non integrata o latente. BC-1 produce delle particelle virali capaci di infettare linfociti B e ciò suggerisce che si tratti di un virus linfotropico. Le linee cellulari infettate solo da HHV-8, in assenza di EBV o altri virus, chiamate BCBL-1 e BC-3, hanno permesso di visualizzare in modo specifico il virione e descriverlo.

Chang e i suoi collaboratori (5), hanno messo in evidenza, in una lesione di Sarcoma di Kaposi associato all’AIDS, due sequenze di 330 e 631 bp, assenti nel DNA di cellule normali e aventi diverse omologie con EBV e l’Herpes virus Saimiri: era chiaro che si trattasse di frammenti genomici di un nuovo virus appartenente alla stessa famiglia. Questo è stato nominato inizialmente KSHV, cioè virus Herpes associato al sarcoma di Kaposi, successivamente si è preferito il titolo di HHV-8 perché si era osservato che la sua infezione poteva causare anche altre patologie, oltre alla malattia di Kaposi, fra cui il linfoma in effusione primaria e il morbo di Castelman.

Vista la rilevanza clinica del KS e considerate le implicazioni epidemiologiche delle infezioni da HHV8, la diagnostica di laboratorio ha assunto negli ultimi anni notevole importanza. Sono state utilizzate molte tecniche per l’indagine fra cui la PCR e diverse tecniche sierologiche. La PCR è stata utile per ricercare le sequenze del virus in più del 90 % delle lesioni del sarcoma di Kaposi in soggetti infettati da HIV, ma ha avuto un’applicazione limitata perché non è in grado di distinguere l’infezione attiva (litica) da quella latente. Sono stati ottenuti risultati più significativi con l’utilizzo di PCR qualitativa o RT-PCR su specifici trascritti virali.

Lo scopo di questo progetto era la produzione di Fab monoclonali ricombinanti, con la tecnica del Fage-Display, volti verso antigeni del virus HHV8.

Materiali e Metodi

Preparazione delle libraries

L'RNA umano è stato estratto da 10 ml di midollo osseo di un paziente sierologicamente positivo per l’HHV8, mediante il prelevamento e la purificazione dei linfociti con centrifugazione in un gradiente di Ficoll per eliminare le componenti polinucleate. L’RNA murino è stato estratto dalla milza di 2 topi BALB, previa immunizzazione con la proteina virale ricombinante K8.1, espressa durante la fase litica (6). Dopo aver titolato la presenza di anticorpi anti-K8.1 dal siero murino (Tabella 1), anche dalla milza sono stati isolati i linfociti tramite centrifugazione in gradiente di Ficoll. La retrotrascrizione dell'RNA è stata effettuata con un (dT)15 primer, utilizzando un kit commerciale per la sintesi del cDNA (Boeringher Mannheim). Il cDNA umano è stato poi amplificato mediante PCR utilizzando un primer specifico per la parte costante sia delle catene leggere che delle catene pesanti e un set di 7-8 primers per ciascuna parte variabile di entrambe le catene (1, 2). La stessa cosa è avvenuta per l’amplificazione delle catene leggere e pesanti murine (Tabella 2). L’amplificazione è avvenuta utilizzando un apparecchio Perkin Elmer 9600, con denaturazione a 94°C per 15 secondi, ibridizzazione a 52°C per 1 min. ed estensione a 72°C per 90 sec. Gli amplificati delle catene leggere e pesanti sono stati successivamente purificati con una elettroforesi su gel di agaroso al 2%, quindi precipitati e quantificati in preparazione della ligazione all'interno del vettore e prima della digestione con gli enzimi di restrizione.

Mediante il fagemide pCombTig è stato possibile trasformare cellule di E. coli (XL1-Blue), in seguito coltivate in SB (super broth) addizionato con glucosio e magnesio per un’ora e seminate successivamente su piastre di LB agar con l’aggiunta di tetraciclina e ampicillina per la selezione delle colonie trasformate.

Tabella 1: Titolazione ELISA del siero murino: lettura allo spettrofotometro a una lunghezza d’onda di 450nm

Il DNA vettore è stato purificato utilizzando un kit Magic Miniprep (Promega) e digerito con gli enzimi di restrizione Xba1 e Sac1 (la library delle catene leggere deve essere clonata prima della library delle catene pesanti per la presenza di un sito per Xba1 nel DNA codificante per le sequenze anticorpali della famiglia VH3 nell'uomo).

Sottoponendo il DNA così digerito ad una elettroforesi su gel di agarosio, è stata individuata la banda del vettore linearizzato, che quindi è stata escissa dal gel, elettroeluita, purificata e quantizzata.

Il vettore pCombTig digerito con Xba1 e Sac1 è stato legato al DNA codificante per le catene leggere mediante un rapporto molare inserto : vettore di 2:1, con T4 DNA ligasi (BRL).

Le cellule XL1-Blue elettrocompetenti sono state elettrotrasformate con questo DNA e fatte crescere in agitazione per 15 min a 37°C. In seguito sono stati aggiunti 10 ml di SB addizionati con tetraciclina 10 mg/ml e ampicillina 50 mg/ml. Le cellule sono state coltivate per un'altra ora e successivamente sono stati aggiunti 100 ml di SB addizionato con tetraciclina 10 mg/ml, ampicillina 100 mg/ml e glucosio 20 mM.

Dopo incubazione per una notte a 37°C, il DNA fagemidico è stato estratto dalla coltura.

Il fagemide è stato digerito con Xho1/Spe1 così da poter combinare le catene pesanti con le catene leggere. La purificazione su gel, la ligation con le catene pesanti amplificate in PCR, e la successiva trasformazione, sono state eseguite come descritto prima per le catene leggere.

Per misurare le dimensioni della library combinatoriale e determinare la frequenza di inserzione delle catene pesanti e leggere, è stata prelevata una aliquota della coltura dopo aver effettuato la trasformazione ed aggiunto 10 ml di SB addizionato con tetraciclina 10 mg/ml e ampicillina 50 mg/ml.

La coltura è stata fatta crescere in agitazione per 1 ora e poi sono stati aggiunti 10 ml di SB addizionato con tetraciclina 10 mg/ml e ampicillina 50 mg/ml. È seguita una incubazione di un'altra ora con una successiva aggiunta di 100 ml di SB addizionati con tetraciclina 10 mg/ml e ampicillina 100 mg/ml. Dopo un'altra ora è stato aggiunto il fago helper VCSM 13 (1012 pfu) e la coltura è stata fatta crescere in agitazione per altre 2 ore, prima di aggiungere kanamicina 70 mg/ml. Infine è seguita una incubazione a 30°C per tutta la notte, in agitazione a 300 rpm.

Tabella 2: primers Fab murini

Mediante centrifugazione a 4000 rpm a 4°C per 15 min, è stato purificato il sopranatante dal quale il fago è stato precipitato con l’aggiunta di glicolpolietilenico 8000 e NaCl, ed incubato in ghiaccio per 30 min. Successivamente il fago è stato centrifugato e il pellet risospeso in PBS + BSA all’1%, per la procedura di panning

.

1.      Panning

Seguendo la tecnica descritta da Burton e coll. (3), è stato possibile eseguire il panning della library combinatoriale.

I fagi esponenti i Fab umani leganti l'antigene sono stati selezionati usando il virus HHV8 parzialmente purificato in gradiente di saccarosio. Il virus è stato ottenuto dalle cellule BC3 (naturalmente infettate dal virus in forma episomiale) dopo la stimolazione con esteri del forbolo (TPA) che consentono il passaggio del virus dalla forma latente a quella litica con la formazione di particelle virali complete.

I Fab murini sono stati selezionati con l’antigene K8.1, lo stesso antigene utilizzato per l’immunizzazione.

Pozzetti di piastre ELISA (Costar) ad alta affinità sono state ricoperte con 0.1 ml di antigene (virus o K8.1) ricostituito in 25 ml di tampone carbonato per una notte a 4°C. La mattina dopo le piastre sono state lavate 10 volte con acqua distillata e bloccate per 1 ora a 37°C con PBS/BSA 1%.

Successivamente la soluzione di bloccaggio è stata eliminata e in ogni pozzetto sono stati aggiunti 50 ml di fago. I fagi sono stati rimossi dopo circa 2 ore di incubazione a 37°C e la piastra ELISA è stata lavata 10 volte con PBS + Tween 20 allo 0.5%. Pipettando con 50 ml di eluition buffer per pozzetto (HCI 0.1 M, pH portato a 2.2 con glicina solida, contenente BSA 0.1%), sono stati eluiti i fagi legati, in seguito neutralizzati ed usati per infettare 2 ml di E. coli XL1-Blue (O.D.600 @ 1) per 15 min con agitazione a 37°C. I batteri infettati, dopo aver aggiunto 10 ml di SB addizionato con tetraciclina 10 mg/ml e ampicillina 50 mg/ml, sono stati incubati per un'altra ora a 37°C (aliquote della coltura sono state prelevate e piastrate per determinare il numero di fagi eluiti dall'antigene). Altri 100 ml di SB addizionato con tetraciclina 10 mg/ml e ampicillina 100 mg/ml sono stati aggiunti alla coltura incubata nuovamente per un’ora prima di aggiungere il fago helper VCSM 13. A questo punto, dopo altre 2 ore di crescita in agitazione è stata aggiunta kanamicina (70 mg/ml) e la coltura è stata incubata per tutta la notte a 30°C.

Gli altri cicli di panning sono stati effettuati come descritto sopra.

Misurando il numero di fagi eluiti per pozzetto, è stato valutato l'incremento del fago antigene-specifico ottenuto con i ripetuti cicli di panning (tabella 3 e 4).

2.      Produzione ed estrazione di Fab

Cellule di E. coli (XL1-Blue) sono stati infettate con i fagi dell'ultimo ciclo del panning. Il fagemide purificato è stato sottoposto a digestione Nhe1/Spe1 al fine di rimuovere il gene cpIII (gene del fago che consente l’esposizione del Fab) e trasformare il sistema phage-display in un sistema secernente Fab solubili. Quindi è stata fatta la reazione di ligazione e, successivamente, la trasformazione di cellule E. coli XL1-Blue con il vettore modificato. Sono state quindi prodotte colonie isolate producenti Fab ricombinanti, le quali, dopo inoculazione in SB addizionato con tetraciclina 10 mg/ml e ampicillina 100 mg/ml sono state incubate a 37°C fino al raggiungimento di una O.D.600 di 1 di adsorbanza. In seguito è stato aggiunto IPTG (isopropilb-D-thiogalactoside) 1 mM e la coltura è stata fatta crescere a 30°C per una notte.

Le cellule sono state poi centrifugate ed il pellet di batteri risospeso in PBS è stato lisato mediante rottura termica (ossia tre ripetuti cicli di congelamento e scongelamento). Mediante centrifugazione, i frammenti dei batteri sono stati fatti sedimentare, e il sopranatante è stato utilizzato nel test ELISA e conservato a -20°C. Ogni colonia batterica contenente il fagemide è stata fatta crescere prima in 10 ml di terreno SB (Super Broth: per 1L sono stati messi 5g di NaCl; 20g di Bacto-Yeast-Extract; 35g di Tryptone; 0,5ml di NaOH 10 M); a questo vengono aggiunti antibiotici quali ampicillina (100 mg/ml finale) e tetraciclina (10 mg/ml finale). Gli antibiotici sono stati aggiunti sterilmente da soluzioni stock e servono per selezionare le cellule batteriche trasformate.

3.      Purificazione di Fab

Dopo un'incubazione a 37°C in agitazione per una notte la coltura batterica è stata subinoculata in 4 beute da 2L riempite ciascuna di 500 ml dello stesso terreno, con le medesime condizioni di crescita. Dopo 4-5 ore sono stati aggiunti a ciascuna beuta 500ml di un induttore: l'isopropil-b-D-tiogalactopiranoside (IPTG) (concentrazione finale 250mg/ml) e il tutto è stato incubato a 30°C O/N. Il giorno seguente la coltura batterica è stata centrifugata a 4000 rpm per 25’ e le cellule risospese in 100 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS); è stata fatta quindi una seconda centrifugazione a 3200 rpm e le cellule sono state risospese in 12 ml di PBS. La sospensione cellulare è stata quindi sottoposta a 3 cicli di 2' di sonicazione con aggiunta nel primo passaggio di un inibitore di proteasi, eventualmente presenti nell’estratto batterico, il phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF). Questa procedura permette la rottura della parete cellulare con liberazione delle proteine plasmatiche e quindi anche del Fab. Successivamente è stata fatta una centrifugazione dei batteri sonicati a 18.000 rpm per 25' e il supernatante, nel quale è presente il Fab solubile, è stato ulteriormente chiarificato mediante filtrazione con filtri da 0,2mm di porosità.

La purificazione dei Fab monoclonali recuperati è stata eseguita attraverso una cromatografia per immuno-affinità.

La resina utilizzata per la preparazione della colonna cromatografica è costituita da “GammaBind G Sepharose” (Pharmacia Biotech, Uppsala, Svezia) legata alla proteina G. La resina è stata più volte lavata con PBS, successivamente coniugata con un siero policlonale (Anti-human Ig G Fab-specific e Anti-mouse, SIGMA) incubando il tutto a temperatura ambiente per 1h in leggera agitazione. Successivamente sono stati fatti 2 lavaggi con sodio borato per eliminare gli anticorpi non legati e portare la resina a pH basico; centrifugazione (1000 rpm per 5’) e risospensione con sodio borato. E' stato aggiunto quindi Dimetilpimelimidato (DMP) al fine di permettere la formazione di legami covalenti tra la proteina G e l’anticorpo. Sono stati fatti 2 lavaggi in etanolamina 0.2M pH 8 e si è lasciato saturare per 2h a temperatura ambiente. La resina è stata lavata per 3 volte con PBS per equilibrare la colonna. Una volta preparata la resina, il campione chiarificato è stato caricato sulla colonna cromatografica preventivamente equilibrata con 20-30 ml di PBS. La colonna è stata poi lavata con ulteriore PBS (50ml) per permettere l’eliminazione delle proteine non legate. Il Fab legato alla colonna è stato recuperato con 10 ml di Elution Buffer (glicina 100mM pH 2.5, portata a pH con HCl) in 8 eppendorf di 1-1,5 ml; queste frazioni sono state prontamente neutralizzate con TRIS (150ml 1M pH 9).

5      Colture cellulari

Per le prove di ELISA è stato isolato il virus HHV8 a partire dalle cellule BC3, che è una linea cellulare naturalmente infettata dall’HHV8 in forma latente. Questa linea cellulare a differenza di altre (es.BC-1, BC2) non è infettata dal virus EBV. Il terreno utilizzato per la crescita è RPMI con il 10% di siero fetale, antibiotici e glutammina (1%). Le cellule dopo 48h dall’induzione con TPA (concentrazione finale 20 ng/ml) sono state recuperate e lisate per shock termico. Dopo aver eliminato i detriti cellulari si è passati all’isolamento e purificazione del virus su gradiente di saccarosio. Il virus così purificato è stato utilizzato per sensibilizzare le piastre del panning, per l’ELISA e per le membrane del dot blot.

6      Allestimento vetrini

Per le prove di immunofluorescenza sono stati allestiti dei vetrini con le cellule BC3 stimolate e raccolte dopo 48 h e non stimolate con TPA.

I vetrini sono stati asciugati e fissati con acetone per 10'.

7      Elettroforesi in SDS page

Per verificare la purezza dell'anticorpo è stata eseguita una corsa elettroforetica su un gel di poliacrilamide all'8%. Dopo aver caricato le frazioni purificate il gel è stato fatto correre per circa 1 h a 120 volt (è stato utilizzato un gel di 10 cm). Successivamente il gel è stato colorato con Coomassie Brillant blue e decolorato.

8      Sequenza

La sequenza nucleotidica è stata determinata secondo il metodo di Sanger et al. 1977 usando un kit commerciale Sequenase 2.0 DNA (United States Biochemical) e i primer utilizzati corrispondono a quelli utilizzati per la costruzione della library (4) (Tabella 2)

RISULTATI

Sono state fatte contemporaneamente 2 libraries: una di Fab umani e una di Fab murini. Per la library umana, si è partiti da un prelievo di midollo di un paziente positivo per la presenza di anticorpi anti-HHV8, è stato estratto l’RNA totale e da questo mediante RT-PCR sono state amplificate le sequenze geniche codificanti le catene leggere e pesanti delle immunoglobuline. Dopo opportuna digestione enzimatica, sono state clonate separatamente in un vettore che consente l’espressione di frammenti Fab sulla superficie dei fagi filamentosi. In seguito il vettore è stato trasformato in E. coli e le cellule sono state infettate con il fago helper. E’ stata costruita così la library ad espressione fagica che abbiamo iniziato a selezionare, per specificità antigenica, mediante ripetuti passaggi sul virus HHV8 precedentemente purificato e fissato su supporto solido (panning). Per la produzione virale abbiamo utilizzato una linea cellulare stabilmente infettata con HHV8, la BC3, e dopo la stimolazione con esteri di forbolo, per l’attivazione del ciclo litico virale, abbiamo recuperato l’estratto virale. Dopo vari cicli di congelamento e scongelamento, il virus è stato purificato su gradiente di saccarosio e utilizzato per il panning. Sono stati eseguiti 5 cicli di amplificazione.

Al termine dei cicli di panning, ottenuti fissando su supporto solido il virus HHV8 parzialmente purificato su gradiente di saccarosio, si è avuto un incremento dei fagi che rimanevano adesi all’antigene virale. Contemporaneamente si è osservato che nel controllo negativo (costituito da BSA) il valore dei fagi eluiti era rimasto pressochè costante. Questo indica che vi è stato un arricchimento di fagi aventi una certa affinità con l’antigene.

Al termine della selezione dal DNA fagemidico è stata rimossa la proteina carrier del fago (Cp3) con opportuni enzimi di restrizione, quindi il vettore è stato utilizzato per la trasformazione di E. coli (XL1 blue). I cloni così ottenuti sono in grado di produrre Fab solubili facilmente saggiabili sia in immunoblot che tramite metodica ELISA. I cloni opportunamente isolati sono stati fatti crescere in brodo (Super Broth e antibiotici), le cellule cresciute sono state indotte (IPTG) e poi lisate per il recupero dei Fab ricombinanti.

In una prima fase sono stati saggiati più di cento cloni in immunoblot, fissando su nitrocellulosa il virus e cimentando i vari Fab. I Fab positivi venivano messi in evidenza successivamente con anticorpi anti-Fab marcati. Da questo primo screening sono risultati positivi diversi cloni che dovevano essere confermati in ELISA. I dati ottenuti in ELISA utilizzando come Ag il virus purificato su gradiente di saccarosio non hanno confermato i dati dell’immunoblot

E’ stato rifatto un nuovo panning utilizzando sempre il virus purificato da cellule BC3 stimolate.

Dopo 5 cicli di panning (tabella 3) e modifica del vettore per l’ottenimento dei Fab solubili sono stati saggiati  in ELISA 125 cloni. Son stati fatti crescere i cloni in SB quindi indotti con IPTG. Le colture così cresciute sono state centrifugate e risospese in PBS e le cellule rotte per congelamento-scongelamento. Quindi sono stati recuperati i surnatanti per il saggio ELISA. I dati ottenuti sono stati difficilmente interpretabili perché sono stati ottenuti segnali troppo bassi per essere considerati positivi.

Contemporaneamente al lavoro appena descritto sono stati prodotti anche Fab ricombinanti murini volti verso proteine specifiche del virus, per un eventuale uso in diagnostica e questo è stato fatto per ottenere Fab monoclonali volti verso antigeni della fase litica e in particolare dell’antigene capsidico K8.1, importante nel legame con il recettore cellulare.

Tabella 3

LIBRARY UMANA

Si è proceduto all’immunizzazione di topi con una proteina ricombinante ottenuta dall’Herpesvirus umano tipo 8. La proteina scelta è una proteina capsidica espressa precocemente durante la fase litica del virus. La proteina è la K8.1 A. Per l’immunizzazione sono state eseguite 3 somministrazioni sottocute con adiuvante. Dopo aver saggiato il titolo anticorpale dal siero del topo con metodica ELISA (tabella 1), è stata prelevata la milza dell’animale sacrificato per l’isolamento dei linfociti tramite gradiente di Ficoll. Dopo l’estrazione dei linfociti si è estratto l’RNA totale e si eseguita la retrotrascrizione in cDNA con una retrotrascrittasi inversa. Dal cDNA si è iniziato ad amplificare i geni per le catene leggere (Lc) degli anticorpi utilizzando un primer specifico per la parte costante e un set di 7 primers per la parte variabile. Si è passati quindi all’amplificazione delle catene pesanti (Hc) dei 3 isotipi IgG1, IgG2a, IgG3 (tabella 1). Per le catene pesanti sono stati utilizzati i tre primers specifici dei tre isotipi per la parte costante mentre per la parte variabile sono stati usati un set di 8 primers differenti.

Dopo l’amplificazione si è proceduto alla purificazione delle catene leggere per elettroeluizione. Dopo aver purificato le catene L queste sono state precipitate in etanolo e digerite con gli enzimi di restrizione Xba-Sac, essendo stati inseriti i siti di taglio specifici nei primers utilizzati durante le amplificazioni. Dopo la digestione le catene L sono state purificate per elettroeluizione e precipitate. E' stato quindi preparato il vettore per la clonazione delle catene L. Il vettore utilizzato è il pCombTIG, un fagemide ad esposizione fagica con inserito il gene per la fosfatasi in posizione Xho-Spe sito di inserzione per le catene pesanti. Per avere una quantità sufficiente di vettore per la clonazione della library delle Lc, sono state trasformate per elettroporazione ad alto voltaggio cellule di E. coli XL1blue (rese elettrocompetenti) con il vettore di clonazione. Le cellule così trasformate sono state fatte crescere in brodo di coltura SB con aggiunta di antibiotici necessari per la selezione delle cellule trasformate. Il vettore è stato purificato grazie a un Kit commerciale per Midiprep (Qiagen).

Come per le catene leggere, sono state amplificate parte delle catene pesanti (Hc) con 1 primer per la parte costante e un set di 8 primers per la parte variabile (tabella 2). Le catene Hc sono state clonate nel vettore previa digestione Xho-Spe. Si è passati alla trasformazione in  XL1 blue della library così ottenuta.

La library è stata sottoposta a panning utilizzando l’antigene ricombinante K.8.1. Dopo 4 cicli di panning è stato modificato il vettore per l’espressione dei Fab in forma solubile (Tabella 4).

Tabella 4

LIBRARY MURINA

Si è passati alla selezione di 20 cloni in ELISA (Tabella 5) usando lo stesso antigene usato per il panning (concentrazione finale di 10µg/ml). Per controllo positivo abbiamo utilizzato sia un siero di un paziente con KS, sia il siero dei topi immunizati, per controlli negativi abbiamo eseguito il test utilizzando come antigene albumina bovina, e per verificare che non vi fossero interazioni tra la K8.1 e l’anticorpo secondario è stata fatta la prova sostituendo i Fab con un anticorpo non specifico.

Tabella 5: Elisa con i Fab monoclonali isolati dopo il panning: lettura allo spettrofotometro a una lunghezza d’onda di 450nm

 La maggior parte dei cloni è risultata positiva al test, per cui si è passati al sequenziamento delle catene pesanti per verificare se si trattasse di uno o più cloni differenti. Dall’analisi delle sequenze abbiamo visto che i Fab erano 2 (Tabella 6).

Tabella 6

SEQUENZA AMINOACIDICA CATENE PESANTI

I due Fab sono quindi stati purificati con una colonna cromatografica per immunoaffinità (nella quale sono presenti anticorpi che si legano in maniera specifica con i Fab murini).

I due Fab ricombinanti ottenuti, possono ora essere utilizzati per una miglior comprensione della patogenesi dell’Herpesvirus 8 umano, non ancora chiara, e in particolare per mettere in evidenza la presenza dell’antigene K8.1 nei tessuti infettati dove è utile stabilire se vi è una riattivazione virale.

Clonaggio e caratterizzazione di anticorpi monoclonali umani ricombinanti

contro gli antigeni del Parvovirus B19.

Questa parte del progetto riguarda la selezione e la caratterizzazione di frammenti anticorpali umani ricombinanti (rFab), a partire da repertori immunoglobulinici clonati in genoteche di tipo “phage-display”, selezionati in base alla loro affinità per antigeni capsidici del Parvovirus umano B19.

Simili strumenti potranno essere utili per l’analisi e l’acquisizione di nuove conoscenze sulla risposta anticorpale umana nei confronti di questa infezione, inoltre anticorpi monoclonali con attività neutralizzante l’infettività virale dovrebbero risultare molto utili come presidio terapeutico/profilattico nei confronti dell’infezione da Parvovirus B19.

Il progetto si è articolato nelle seguenti fasi:

1.      Selezione del donatore per il clonaggio del repertorio anticorpale a partire da cellule B.

Nella sua prima fase, il progetto prevedeva l’ottenimento di cellule B da donatori, sieropositivi per il Parvovirus B19, da cui effettuare il clonaggio del repertorio anticorpale.

La reattività sierologica dei donatori è stata valutata mediante saggi immunoenzimatici (ELISA) utilizzando una fase solida (pozzetti di polistirene) sensibilizzata con la proteina Vp2 del parvovirus umano B19, prodotta in forma ricombinante in Baculovirus (gentilmente fornitoci dalla ditta “Diesse” di Siena). Ad ogni pozzetto è stato aggiunto un siero da analizzare e, per la rilevazione della reattività, è stato aggiunto un antisiero di capra anti-IgG umane coniugato con perossidasi di rafano, e un apposito substrato (ABTS). Come controllo per la specificità di legame degli anticorpi anti-Parvovirus sono stati utilizzati pozzetti sensibilizzati con tampone bloccante. In ogni prova sono sempre stati inclusi opportuni controlli relativi al segnale di fondo dovuto al substrato e al coniugato.  Nel corso di questa fase preliminare del progetto di ricerca, in seguito allo “screening” effettuato, è stato individuato un potenziale donatore per il clonaggio del repertorio anticorpale, identificato con la sigla RP.

2.      Costruzione della genoteca combinatoria di tipo “phage-display” rappresentativa del repertorio immunoglobulinico del donatore

E’ stata costruita una genoteca combinatoria rappresentativa del repertorio anticorpale IgG1-k, a partire da cellule B ottenute dal donatore sieropositivo RP. A questo scopo, dalle cellule B è stato estratto l’RNA totale ed è stata effettuata la retrotrascrizione degli RNA messaggeri in DNA “copia” (cDNA); la corretta retrotrascrizione in cDNA dell’RNA messaggero è stata verificata mediante prova di amplificazione, per PCR, del cDNA per l’enzima  gliceraldeide-3-fosfato-deidrogenasi (GAPDH), che è risultata positiva. A partire dal cDNA, sono state amplificate selettivamente le regioni codificanti le catene leggere (LC) di tipo k e la porzione Fd (VH-CH1) delle catene pesanti (HC) di sottoclasse g1. Le reazioni di amplificazione sono state effettuate utilizzando una DNA polimerasi termostabile ad alta fedeltà per minimizzare l’introduzione di mutazioni indesiderate durante la fase di amplificazione in vitro. Per le reazioni di amplificazione sono stati utilizzati, al 5’, primer per 6 sottofamiglie diverse di framework delle regioni variabili Vk e primer per 8 sottofamiglie diverse di framework delle regioni variabili VH; al 3’ sono stati utilizzati un primer disegnato in corrispondenza del dominio costante CL della catena leggera di tipo k, e un primer disegnato in corrispondenza del dominio costante CH1 della catena pesante di sottoclasse g1. Per facilitare il successivo clonaggio dei prodotti di amplificazione ottenuti, i primer sono stati disegnati in modo tale da introdurre siti di taglio per enzimi di restrizione.

I prodotti di amplificazione codificanti per LCk sono stati clonati nel vettore di tipo “phage-display” pCIIIH; il numero di cloni utili ottenuti per la genoteca di catene leggere k è risultato essere pari a 1,3 x 105. I prodotti di amplificazione codificanti per la porzione Fd (VH-CH1) delle catene pesanti (HC) di sottoclasse g1 sono stati quindi clonati nel vettore di tipo “phage-display” in cui erano state precedentemente clonati i frammenti codificanti per le catene leggere, e il numero di cloni utili ottenuti per la genoteca combinatoria IgG1k è risultato essere pari a 1,8 x 106. Tale numero è stato ritenuto siddisfaciente per garantire una buona rappresentatività della genoteca. L’efficienza delle fasi di clonaggio delle catene leggere e pesanti è sempre stata verificata mediante una procedura di immunoscreening su colonia messa a punto in precedenza, allo scopo, nel nostro laboratorio.

Una volta costruita, la genoteca combinatoria è stata convertita in formato phage-display infettando le cellule batteriche con il fago helper VCS-M13. In questo modo viene ottenuta una popolazione di batteriofagi filamentosi ciascuno dei quali espone un Fab sulla propria superficie e porta al suo interno un fagemide con i cDNA corrispondenti. Le paricelle fagiche sono state recuperate dal supernatante del terreno di coltura mediante precipitazione con polietilene-glicol, e risospese alla concentrazione desiderata. La genoteca nel formato  phage display è stata utilizzata per la selezione di cloni che producono anticorpi ricombinanti specifici per l’antigene desiderato.

3.      Selezione di cloni batterici produttori di frammenti Fab ricombinanti (rFab) nei confronti di antigeni del parvovirus umano B19

La selezione dei cloni che producono anticorpi virus-specifici a partire dalla genoteca combinatoria rappresentativa del repertorio anticorpale del donatore RP è stata condotta mediante una metodica di immunoaffinità (panning). Come fase solida per la procedura di panning sono stati utilizzati micropozzetti di polistirene sensibilizzati con antigene Vp2 ricombinante, come già descritto per la fase di ricerca riguardante la selezione dei donatori (vedasi al punto 1).

Il primo giro di panning è stato effettuato utilizzando la genoteca in formato phage-display, ottenuta come descritto in precedenza (vedasi punto 2). Il contatto tra particelle fagiche ed antigene è stato effettuato per 2 ore a 25 °C. Il lavaggio dei pozzetti per rimuovere le particelle fagiche non adese o adese in maniera aspecifica è stato effettuato con tampone PBS contenente un detergente (tween 20). Le particelle fagiche rimaste adese dopo il lavaggio sono state eluite mediante l’utilizzo di una soluzione a pH acido. Dopo l’eluizione la sospensione è stata immediatamente neutralizzata, e le particelle fagiche eluite sono state amplificate in E. coli infettando le cellule batteriche e recuperando i fagemidi mediante superinfezione con fago helper VCS-M13. Le particelle così recuperate sono state separate mediante precipitazione con polietilene-glicol, e utilizzate per il successivo giro di panning. Complessivamente sono stati effettuati 4 giri di panning, mantenendo le stesse condizioni utilizzate per il primo fatta eccezione per il numero dei lavaggi, che è stato progressivamente aumentato (da 1 a 4) al fine di aumentare progressivamente la stringenza della selezione. L’andamento del panning è stato seguito determinando, per ogni giro, il numero di fagi messi in contatto con l’antigene e la frazione dei medesimi rimasta adesa alla fase solida ed eluita dopo i lavaggi. Al termine del quarto giro di panning il DNA fagemidico è stato estratto dalle cellule batteriche infettate con i fagi eluiti e, dopo aver rimosso la regione codificante la proteina fagica cpIII, è stato utilizzato per ottenere cloni batterici che producono rFab in forma solubile a livello dello spazio periplasmico.

I cloni batterici produttori di rFab in forma solubile sono stati subcoltivati in terreno liquido, e da ciascuno di essi è stato preparato un estratto grezzo di rFab. Per la preparazione dell’estratto grezzo le cellule batteriche, cresciute nel terreno di coltura contenente l’antibiotico per la selezione del fagemide, venivano raccolte per centrifugazione, risospese in una soluzione tamponata a pH neutro, e sottoposte a 3 cicli di congelamento a -20°C e scongelamento a t. a.. La sospensione cellulare veniva quindi centrifugata e il sopranatante così recuperato costituiva la preparazione grezza di rFab.

Le preparazioni grezze di rFab sono state saggiate per la loro reattività, mediante saggio immunoenzimatico ELISA, con preparazioni antigeniche di Parvovirus B19 rappresentate dall’antigene ricombinante Vp2. In seguito allo screening, sono stati ritrovati tre cloni che reagivano specificamebte, in modo riproducibile, verso la proteina capsidica Vp2 del Parvovirus umano B19. Uno dei cloni è stato caratterizzato dal punto di vista della sequenza nucleotidica, che si è rivelata originale.

CONCLUSIONI

 Sono stati prodotti due anticorpi monoclonali ricombinanti (frammenti Fab) diretti il primo verso l’antigene K 8.1 del virus Herpes 8 umano, l’altro verso la proteina VP2 del Parvovirus B19.

   Dal momento che la proteina K 8.1 è espressa solo dal virus in fase produttiva, è possibile con questo anticorpo dimostrare la riattivazione del virus HHV8 nelle cellule in coltura e verosimilmente anche in vivo. Questo è importante da un punto di vista clinico, perché il virus in fase latente può essere presente in molti individui senza creare alcun problema, ma la sua riattivazione è da mettere in relazione ad una fase litica, che può essere indice di un funzionamento deficitaria del sistema immunitario dell’ospite, con possibile evoluzione verso patologie di tipo proliferativo.

L’anticorpo monoclonale costituirà la base per la produzione di un kit diagnostico specifico per l’HHV8 in fase produttiva. Inoltre lo stesso anticorpo ha proprietà tali che ne fanno prospettare un possibile uso a scopo profilattico o terapeutico.

La proteina VP2 del Parvovirus B19 è quella maggiormente rappresentata sulla superficie del capside del virus, quindi è la più esposta all’azione del sistema immunitario di un eventuale ospite. Pertanto questo anticorpo monoclonale ha una potenziale attività non solo a scopo diagnostico, ma anche a scopo profilattico/terapeutico. In alcuni paesi del mondo occidentale (Francia, Inghilterra) il Parvovirus è considerato un virus pericoloso a livello sociale, la cui trasmissione è facilitata dalle trasfusioni di sangue e di emoderivati. Pertanto ne è stata resa obbligatoria la determinazione in tutti i campioni di materiale ematico per uso trasfusionale, come si fa abitualmente per i virus epatitici e HIV. E’ possibile che un’azione analoga si verifichi in Italia entro breve tempo. Questo fatto rende l’attuale ricerca ancora più attuale e potrà aprire all’anticorpo prodotto in questa ricerca mercati sempre più ampi.

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