SOTTOPROGETTO 1

 

Estrazione di principi biologicamente attivi da microalghe

Responsabile scientifico: Prof. Raffaello Pompei Cattedra di Microbiologia Applicata, Università di Cagliari

 

INTRODUZIONE

L’interesse verso le colture microalgali è relativamente recente e comunemente rivolto all’uso in acquacoltura per la riproduzione artificiale di mitili e pesci.^1,2) Negli anni, l’interesse su questi microrganismi si sta rivolgendo anche ad altre possibili utilizzazioni. Sempre più i loro prodotti metabolici, come lipidi, proteine, carboidrati, pigmenti, vitamine, sono presenti nelle diete degli animali e dell’uomo.^3,4,5) Alcuni loro metaboliti inoltre sembrano possedere proprietà farmacologiche: anticolesterolo, antitumorale, immunomodulante, antibatterica ed antimicotica.

Dall’alga marina Chlorella vulgaris è descritta la produzione di una molecola di natura gliceroglicolipidica con attività antitumorale;^6,7) sempre da questa microalga è stata isolata una glicoproteina immunostimolante, capace di stimolare le difese dell’ospite nelle infezioni batteriche (E. coli e Listeria) e virali (CMV).⁸⁾

Estratti acquosi di Chlorella autotrophica, Porphyridium cruentum ed Ellipsoidon sp. inducono, in vitro, una significante inibizione del virus VHSV (virus della setticemia emorragica del salmone) e del virus ASFV (virus della febbre ondulante africana).⁹⁾

Dalle colture di Tetraselmis suecica e Isochrysis galbana è stato ottenuto un estratto acquoso attivo sul sistema nervoso. Sempre dalla T. suecica vengono ottenuti degli estratti ad attività antibiotica sui batteri patogeni dei pesci.¹⁰⁾

Dalla microalga Haematococcus pluvialis viene prodotta, solo nella fase cistica del suo ciclo cellulare, l’Astaxantina, un ketocarotenoide utilizzato come additivo alimentare per la pigmentazione di pesci e crostacei con proprietà antiossidante, anticancerogena ed immunomodulante.^{11,12,13,14,15)}

   Nel presente lavoro alcune alghe sono state studiate come fonte di principi biologicamente attivi, in particolare sono state analizzate per l’attività antimicrobica, antivirale e citotossica.

A tal fine inizialmente è stato messo a punto in laboratorio il sistema di coltivazione di 5 diverse microalghe presenti nelle coste della Sardegna e successivamente si è provveduto al trasferimento dei risultati ottenuti ad aziende del settore per la produzione su più vasta scala.

La biomassa recuperata da queste colture è stata sottoposta a screening biologici e le colture interessanti da questo punto di vista sono state quindi sottoposte a processi di estrazione e purificazione.

 

MATERIALI E METODI

 

Coltura di microalghe in laboratorio

In questo lavoro sono state studiate cinque diverse specie di microalghe marine e d’acqua dolce:

1.      Chlorella sp., alga d’acqua marina (Chlorophyta, Chlorococcale, Chlorellaceae), unicellulare, fotosintetica, priva di flagelli allo stadio vegetativo e pertanto immobile. Non è stata determinata la specie.

2.      Chlorella minutissima, alga d’acqua marina (Chlorophyta, Chlorococcale, Chlorellaceae), simile morfologicamente alla Chlorella sp. di dimensioni più piccole. 

3.      Haematococcus pluvialis, alga d’acqua dolce (Chlorophyta, Volvocales), unicellulare, biflagellata. In relazione alle condizioni ambientali, tali microalghe perdono la motilità e si trasformano in cisti, denominate aplanospore, che assumono una colorazione rosso-arancio dovuta alla produzione di astaxantina.

4.      Tetraselmis suecica, alga d’acqua marina (Chlorophyta, Chlorodendrales, Tetraselmidaceae), fitoflagellato caratterizzato da una copertura di scaglie non mineralizzate e da quattro flagelli, piuttosto spessi e lunghi quasi quanto il corpo cellulare. Questi mancano nella fase di divisione cellulare che avviene in uno stadio non mobile con formazione di due zoospore per cellula (sprovviste di flagelli nella teca). Possono verificarsi formazioni di cisti.

5.      Isochrysis sp., alga d’acqua marina (Chrysophyta, Chrysophyceae), unicellulare, fotosintetica, di piccole dimensioni, con due flagelli disuguali di cui il posteriore molto ridotto.

Per la coltivazione sono stati impiegati due tipi di terreni:

terreno di Walne in acqua di mare per Chlorella sp., Chlorella minutissima, Isochrysis sp., Tetraselmis suecica (con qualche variante per quest’ultima): Na₂EDTA (45 mg/l), NaNO₃ (100 mg/l), NaH₂PO_4.2H₂O (20 mg/l), MnCl₂4.H₂O (0.32 mg/l), FeCl₃6.H₂O (1.3 mg/l), HNO₃ (33.6 mg/l)), ZnCl₂ (0,021 mg/l), CoCl_2.6H₂O (0,02 mg/l), (NH₄)₆Mo₇O_24.4H₂0 (0,009 mg/l), CuSO_4.5H₂O (0,02 mg/l)), tiamina cloridrato (2 mg/l), Cianocobalamina (0.1 mg/l));^16,17)

terreno di base per la coltura di Haematococcus pluvialis, costituito dai seguenti elementi addizionati ad acqua distillata: KNO₃ (410mg/l), NaHPO₄ (30 mg/l), MgSO_4.7H₂O (246.5 mg/l), Cl₂Ca2.H₂O (110.9 mg/l), Cl₂Co6.H₂O (0.011 mg/l), CuSO_4.5H₂O (0.012 mg/l), Cr₃O₂ (0.076 mg/l), MnCl_3.4H₂O (0.989 mg/l), Na₂MoO_4.2H₂O (0.12 mg/l), SeO₂ (0.005 mg/l), Biotina (0.25 mg/l), Tiamina (0.0175 mg/l), Cianocobalamina (0.015 mg/l), FeCl_3.6H₂O (3.15 g/l).¹⁸⁾

Tutte le soluzioni sono state sterilizzate per filtrazione.

Sono state allestite diverse colture in beute sterili da 1L, con un inoculo di 10⁵ cell/ml, calcolato secondo la seguente formula:                                                          

(N°cell/ml )=Y*C/V_f

(N°cell/ml )= 10⁵ cell/ml densità cellulare imposta;

Y= volume di inoculo da prelevare dalla coltura madre;

C= densità cellulare/ml  della coltura madre;

V_f= volume del nuovo preparato;

 

Le beute venivano incubate a temperatura ambiente ed esposte (non in maniera diretta) alla luce del giorno. Per favorire l’aerazione (CO₂) le fiasche sono state tenute col tappo leggermente aperto e ogni 12 h erano agitate. Il pH dei preparati è stato mantenuto tra 6 e 7.

Ogni 3-4 giorni veniva eseguita la conta delle cellule algali con la camera di Neubauer,¹⁸⁾ allo scopo di verificare la velocità di crescita nel corso della produzione; inoltre si è provveduto al controllo di purezza dei preparati mediante la semina in terreni solidi (terreno di Walne reso solido con l’aggiunta di 9 gr. di agar batteriologico).

Le colture algali dopo aver raggiunto la fase esponenziale di crescita sono state bloccate e si è provveduto quindi al recupero della biomassa. Le colture di Chlorella sp., Chlorella minutissima, Haematococcus pluvialis, ed Isochrysis  sono state centrifugate per 15 minuti a 4000 RPM, mentre quelle di Tetraselmis suecica sono state centrifugate per 15 minuti a 5000 RPM. Il pellet recuperato è stato disidratato mediante liofilizzazione e conservato a 4°C fino all’utilizzo.

 

Screening dell’attività biologica

I liofilizzati dei diversi tipi di alghe sono stati sottoposti a test in vitro per valutarne l’attività antimicrobica, citotossica ed antivirale. Di tutte le alghe sono state preparate soluzioni alla concentrazione di 20 mg/100 ml di DMSO.

 

Attività antibatterica ed antifungina

Per l’attività antibiotica sono stati utilizzati i seguenti microrganismi: Staphylococcus aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922, Candida albicans 5M.

L’attività antimicrobica è stata valutata, alla dose di 2 mg/ml, col metodo delle diluizioni in agar, sul terreno Mueller-Hinton per la crescita dei batteri e Casitone per i lieviti. L’inoculo era di 10^{5 cellule}/ml sia per batteri che per lieviti. La crescita microbica era valutata dopo 48 ore di incubazione a 37°C e riportata in tabella come Minima Concentrazione Inibente (MIC).¹⁹⁾

 

Attività citotossicà ed antivirale

La citotossicità è stata valutata su cellule della linea continua Vero, coltivate su terreno Dulbecco’s modified MEM (Gibco Laboratorie INC) con il 2% di siero fetale di vitello, e sulla linea cellulare MDCK, cellule renali di cane, (Gibco Laboratories INC) cresciute su terreno MEM con il 2% di siero fetale di vitello. Le cellule venivano disposte in piastre da 48 pozzetti, alla densità di circa 4x10⁴ cellule per pozzetto. Dopo 48 ore di incubazione in termostato a 36°C e 5% CO₂ , in presenza di dosi scalari delle sostanze in esame, a partire dalla concentrazione di 2 mg/ml, si leggeva la tossicità al microscopio ottico come effetto sulla moltiplicazione cellulare. In questo modo veniva calcolata la MNTD₅₀, ovvero la dose massima non tossica, che provoca la riduzione del 50% del numero di cellule rispetto al controllo. Contemporaneamente è stata valutata l’attività antivirale su virus HSV2 (Herpes simplex tipo 2), 1S (Polio virus tipo Sabin) e WSN (Virus dell’influenza suina tipo A), determinando la ID₅₀, dose inibente il 50% l’effetto citopatico rispetto al controllo.²⁰⁾

 

Concentrazione, purificazione e isolamento di sostanze bioattive

Sono state allestite produzioni massive di Haematococcus pluvialis e Tetraselmis suecica in un impianto semiautotomatizzato presso la Depas di Selargius con condizioni di crescita controllate.

Haematococcus pluvialis

Dalla biomassa secca ottenuta dalle colture di questo impianto dopo opportuna concentrazione e disidratazione sono state preparate 4 aliquote di 1 grammo ciascuna e sottoposte, previa omogeneizzazione, a macerazione x 12 ore con 4 diversi solventi organici: MeOH, CHCl3, Acetone ed Esano. Dopo aver separato per filtrazione la parte corpuscolare dal solvente, quest’ultimo è stato portato a secco con un evaporatore sottovuoto. Gli estratti ottenuti sono stati quindi quantificati e risospesi in DMSO per l’utilizzo nel saggio biologico.

Dopo aver avuto la conferma che il principio attivo risulta estraibile con i solventi polari è stato preparato un nuovo campione e sottoposto ad estrazione con la miscela Folch, CHCl₃- MeOH (2:1).

Le due fasi della miscela vengono separate aggiungendo un volume di H₂O pari al MeOH presente ed eliminando la fase idroalcolica. La fase in CHCL₃, previa essiccazione è stata sottoposta a saponificazione con Et-OH-KOH. A questo punto la fase insaponificabile della miscela è stata separata dalla fase saponificata mediante l’aggiunta di esano.

Le diverse frazioni dei vari step di purificazione sono state portate a secco sempre per evaporazione sottovuoto a freddo e preparate per il saggio biologico.

 

Tetraselmis suecica

Anche la biomassa disidratata, ottenuta dalla coltivazione di questa microscopica alga, è stata sottoposta ad estrazione con solventi organici allo scopo di concentrare il principio con attività citotossica.

In dettaglio 3 aliquote (di 1 gr.) di biomassa sono state, previa omogeneizzazione, macerate per 12 ore con 3 diversi solventi: MeOH, CHCl₃ ed Esano.

Dopo aver separato per filtrazione la parte corpuscolare dal solvente, quest’ultimo è stato portato a secco con un evaporatore sottovuoto. Gli estratti ottenuti sono stati quindi quantificati e risospesi in DMSO per l’utilizzo nel saggio biologico.

Anche in questo caso, come per Haematococcus pluvialis, un nuovo campione di Tetraselmis suecica è stato sottoposto ad estrazione con la miscela Folch, e successivamente a saponificazione ed estrazione con esano.

 

Conferma dell’attività citotossica

L’attivita citotossica dei vari estratti è stata confermata con la metodica precedentemente riportata utilizzando, oltre alle cellule VERO ed MDCK, anche le cellule Hela (adenocarcinoma cervicale umano).

 

RISULTATI

Crescita di microalghe in laboratorio

Nella prima fase del lavoro si è provveduto sia all’isolamento dei diversi ceppi algali in terreni agarizzati da eventuali inquinanti batterici e da altri tipi di alghe, che alla messa a punto in laboratorio (piccoli volumi) delle condizioni abiotiche (luce, CO2, T°, terreno di crescita) e biotiche ottimali di crescita;

Più precisamente la sperimentazione ha portato alla crescita ottimale delle 5 diverse specie di alghe in studio: Chlorella sp., Chlorella minutissima, Haematococcus pluvialis, Tetraselmis suecica, ed Isochrysis sp.

Dal queste colture algali è stata recuperata la biomassa, ottenendo per ciascuna alga, mediante centrifugazione e liofilizzazione, una polvere quantificabile di colore verde.

 

Screening dell’attività biologica

Gli estratti algali studiati alla dose di 2 mg/ml non sono risultati in grado di inibire i ceppi di batteri (S. aureus e E. coli) e lieviti (C. albicans) utilizzati.

La tabella 1 riporta lo screening dell’attività citotossica ed antivirale su due tipi di cellule, Vero ed MDCK e tre tipi di virus HSV2 (Herpes simplex 2), 1S (Polio virus) e WSN (Virus influenzale), dei diversi campioni a partire dalla dose di 2 mg/ml.

Le alghe Haematococcus pluvialis e Tetraselmis suecica hanno mostrato un’interessante attività citotossica con MNTD₅₀ rispettivamente di 50 e 32  mg/ml, sia sulle cellule Vero che MDCK.

Le alghe Chlorella sp., Clorella minutissima e Isocrysis sp. sono risultate poco tossiche (MNTD₅₀ tra 250 e 1000 mg/ml) sui due tipi di cellule utilizzate.

Non è stata evidenziata attività antivirale significativa sui virus presi in esame di alcun campione a dosi inferiori a quelle tossiche.

 

Concentrazione, purificazione e isolamento di sostanze bioattive

Nella seconda fase il lavoro si è soffermato sullo studio dell’attività citotossica mostrato dai due ceppi algali: Haematococcus pluvialis e Tetraselmis suecica.

A tal fine è si è passati dalla sperimentazione in laboratorio a produzioni massive di 40, 60 L.

Haematococcus pluvialis.

Dalla coltura di quest’alga è stata ottenuta una polvere secca che è stata sottoposta a processi di purificazione con diversi solventi organici a diversa polarità, allo scopo di individuare il principio attivo dalla miscela di composti, oltre che verificare la natura lipofila o idrofila della sostanza.

Come risulta dalla tabella 2, tra i diversi solventi organici utilizzati il principio attivo si concentra nel MeOH e soprattutto nel CHCl₃; infatti mostrano sulle cellule VERO rispettivamente un MNTD₅₀ di 25 mg/ml e 20 mg/ml, mentre è risultato non estraibile con l’esano (MNTD₅₀ >110 mg/ml) e l’acetone (MNTD₅₀> 168 mg/ml ). Probabilmente si tratta di una molecola mediamente polare, di natura lipofila.

Utilizzando la miscela MeOH- CHCl₃ il principio si concentra maggiormente rispetto ai solventi presi singolarmente, infatti, la MNTD₅₀ della miscela, sempre sulle cellule VERO scende a 13 mg/ml.

Sottoponendo la fase in MeOH della miscela Folch a saponificazione e successiva estrazione della parte insaponificabile con l’esano, il principio si ritrova concentrato proprio in questa fase esanica ((MNTD_{50 =} 8 mg/ml)

La citotossicità dei vari estratti analizzati è per lo più la stessa nelle cellule VERO ed Hela mentre sulle MDCK risulta meno marcata.

Tetraselmis suecica

Come risulta dalla tabella 3, tra i diversi solventi organici utilizzati il principio attivo si concentra in particolare nella fase cloroformica, infatti l’attività citotossica passa da 50 mg/ml dell’estratto grezzo a 15,6 mg/ml in questa fase; il principio risulta leggermente estraibile anche col MeOH (MNTD₅₀ =40 mg/ml ) mentre risulta poco concentrato nella fase esanica (MNTD₅₀ =250 mg/ml).

Anche il macerato in Folch (2TSMA) e l’Estratto esano-insaponificabile (2TSE) estraggono il principio ma non lo concentrano in particolar modo rispetto al macerato in cloroformio (2TSMF).

 

 

CONCLUSIONI

 

Delle 5 specie di alghe esaminate, 2, Haematococcus pluvialis e Tetraselmis suecica, hanno mostrato una evidente attività tossica su colture di cellule tumorali umane ed animali.

L’attività citotossica è stata individuata prevalentemente nella frazione lipofila degli estratti di alghe e può essere concentrata con miscele di metanolo e cloroformio.

   Occorrono ulteriori analisi per definire il tipo di molecole coinvolte e il loro meccanismo di azione sulle cellule tumorali.

 

BIBLIOGRAFIA

 

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Tabella 1- Screening attività citotossica ed antivirale di estratti di microalghe

 

 

	Attività citotossica		Attività antivirale
Campioni di alghe	Cellule		Virus
	MDCK	VERO	WSN	HSV2	1S
	MNTD50 mg/ml		ID50 mg/ml
Tetraselmis suecica	50	50	> 50	> 50	50
Haematococcus pluvialis	32	32	> 32	32	32
Isocrysis sp.	250	500	> 250	500	500
Chlorella sp.	500	1000	> 500	1000	1000
Chorella minutissima	750	750	> 750	> 750	>750

MNTD₅₀, = Dose massima non tossica che provoca la riduzione del 50% del numero di cellule rispetto al controllo;

ID₅₀=dose inibente del 50% l’effetto citopatico rispetto al controllo; MDCK= Cellule renali di cane; VERO=Cellule renali di scimmia; Hela= Cellule di adenocarcinoma umano; WSN=Virus dell’influenza suina tipo A; HSV2=Herpes simplex tipo 2; 1S=Polio virus tipo Sabin.
Tabella 2- Attività citotossica di estratti parzialmente purificati di Haematococcus pluvialis (HP)

 

 

Estratti	Attività citotossica MNTD50 mg/ml
	VERO	MDCK	Hela
1HP Estratto grezzo	32	32	64
HPMM Macerato-metanolo	25	30	25
HPMC Macerato-cloroformio	20	30	20
HPMA Macerato-acetone	> 168	> 168	168
HPME Macerato-esano	> 110	> 110	> 110
2HPMF Macerato in Folch	13	26	26
2HPE Estratto-esano-insap.	8	8	8

MNTD₅₀, = Dose massima non tossica che provoca la riduzione del 50% del numero di cellule rispetto al controllo.

MDCK= Cellule renali di cane; VERO=Cellule renali di scimmia; Hela= Cellule di adenocarcinoma umano;

 

 

Tabella 3- Attività citotossica di estratti parzialmente purificati di

Tetraselmis suecica (TS)

 

 

Estratti	Attività citotossica MNTD50 mg/ml
	Cellule VERO
1TS Estratto grezzo	50
2TSM Macerato-metanolo	40
2TSMC Macerato-cloroformio	15,6
2TSME Macerato-esano	250
2TSMF Macerato in Folch	32
2TSE Estratto-esano-insap.	32

MNTD₅₀, = Dose massima non tossica che provoca la riduzione del 50% del numero di cellule rispetto al controllo.

VERO= Cellule renali di scimmia;

 

SOTTOPROGETTO 2

 

Estrazione e caratterizzazione di acidi grassi polinsaturi da alghe e piante acquatiche

 

La coltivazione di organismi marini è un'industria che sta acquistando una notevole importanza nel campo della produzione di biomasse per l'allevamento dei pesci, o di prodotti per l'industria alimentare, farmaceutica e cosmetica.

Nell'ambito del progetto "Ottenimento di biomasse e farmaci da alghe e piante acquatiche", l'attività di ricerca del gruppo di Patologia Sperimentale, è stato rivolta allo studio delle microalghe quali potenziali produttori di acidi grassi omega-3.

L'utilizzo delle microalghe come fonte alternativa degli acidi grassi w-3 sta diventando sempre più importante in considerazione del fatto che questi prodotti stanno trovando una loro ampia collocazione anche nell'industria alimentare e farmaceutica. Sono ben note le attività biochimiche e le proprietà farmacologiche degli acidi grassi polinsaturi come l'acido eicosapentaenoico (EPA, C20:5 w-3), l’acido docosaesaenoico (DHA, C22:6 w-3) e l’acido a-linolenico (ALA, C18:3 w-3). Tutti questi acidi grassi sono sintetizzati da piante marine uni e pluricellulari, alghe e fitoplancton e, risalendo la catena alimentare, vengono incorporati nei tessuti degli animali marini superiori. Gli oli di pesce sono la principale fonte degli n-3 PUFA per l'uomo, ma attualmente l'interesse è rivolto verso il recupero di tali componenti lipidici da biomasse di origine marina alternative, come diverse specie microalghe, ricche di oli contenenti quantità variabili  di acidi grassi w-3.

Le microalghe vengono inoltre ampiamente utilizzate come alimento nelle avannotterie e negli schiuditoi di molluschi; il loro valore nutritivo è strettamente correlato al contenuto di acidi grassi polinsaturi w-3, che, introdotti con la dieta, favoriscono migliori tassi di accrescimento e sopravvivenza larvale.

Un certo numero di fattori contribuisce all’interesse nei confronti della coltivazione delle microalghe quali fonti potenziali di questi metaboliti ad elevato valore aggiunto:

·        l’elevata attività fotosintetica e l’adattabilità ai fattori ambientali, che determinano versatili condizioni di crescita;

·        la composizione chimica delle microalghe è condizionata dal medium di crescita e dall’ambiente;

·        la possibilità di manipolare le condizioni di coltura e modificare i prodotti algali secondo le specifiche esigenze.

L'esecuzione del progetto di ricerca “Ottenimento di biomasse e farmaci da alghe e piante acquatiche ” ha previsto:

q       lo sviluppo della migliore tecnica di estrazione, frazionamento e caratterizzazione degli acidi grassi polinsaturi w-3 dalle microalghe, con ottimizzazione dei parametri operativi per un recupero mirato, tenendo conto dei processi ossidativi connessi. L'estrazione dei materiali lipidici richiede dei metodi blandi, rapidi e riproducibili, per minimizzare la degradazione ossidativa e la presenza di artefatti;

q       l'identificazione dei ceppi di microalghe facilmente coltivabili e naturali produttori degli acidi grassi di interesse. L'obiettivo prefisso era quello di selezionare delle microalghe superproduttrici di acidi grassi  w-3, da destinare agli impianti di acquacoltura, e di ottenere un olio di qualità, contenente notevoli quantità di un singolo acido grasso w-3 bioattivo, e che potesse essere competitivo con l’olio di pesce raffinato e deodorizzato per alimentazione ed uso farmaceutico.

E' stata effettuata l'estrazione dei lipidi, l’analisi della composizione quali-quantitativa degli acidi grassi insaturi di una serie di differenti specie di microalghe. La comparazione dei dati ottenuti ha permesso di poter identificare le alghe naturalmente ricche e potenzialmente arricchibili con trattamenti particolari in fase di coltura.

Protocollo sperimentale di estrazione e purificazione dei materiali lipidici dalle microalghe

La procedura sperimentale per l’analisi completa dei materiali lipidici dalle biomasse microalgali ha previsto:

·      l’estrazione dei lipidi totali mediante l'impiego di solventi selettivi;

·      la quantificazione dei lipidi totali;

·      l’isolamento della frazione saponificabile dall' insaponificabile;

·      la determinazione della composizione quali-quantitativa in acidi grassi insaturi mediante HPLC.

Estrazione dei lipidi totali

L’estrazione dei lipidi totali  è stata effettuata mediante la metodica del Folch leggermente modificata. Aliquote (500 mg) dei campioni di microalghe sono state omogenate in un volume opportuno del reagente del Folch, miscela CHCL₃:MeOH 2:1. Dopo 1 ora di incubazione al buio e addizione di 4 ml di H₂O, i campioni sono stati agitati e lasciati ad incubare un’altra ora al buio. Dopo 1 ora di centrifugazione a 900´g, dalla fase cloroformica sono state prelevate aliquote per le successive analisi.

Determinazione quantitativa dei lipidi totali

La quantificazione dei lipidi totali è stata eseguita con il metodo del Chiang, reazione colorimetrica di ossidoriduzione. Aliquote della fase cloroformica sono state portate a secco, sottovuoto, e successivamente trattate con 1.5 ml della soluzione del Chiang (soluzione di bicromato di potassio in H₂SO₄). Dopo agitazione, i campioni, sono stati incubati a 100 °C per 30 minuti. Dopo raffreddamento in ghiaccio, l'aggiunta di 1.5 ml di H₂O e vigorosa agitazione, i campioni sono stati letti allo spettrofotometro a 600 nm. Per la determinazione quantitativa  è stata utilizzata una curva di taratura ottenuta dalla lettura di aliquote note di lipidi (soluzione 1mg/ml in CHCl₃).

Preparazione degli acidi grassi

 La preparazione degli acidi grassi liberi è stata effettuata mediante blanda saponificazione. Aliquote (3 mg) di ciascun estratto lipidico sono state dissolte in 5 ml di etanolo, e successivamente sono stati addizionati 100 ml di Desferal, 1 ml di una soluzione acquosa di acido ascorbico al 25% e 0.5 ml di KOH 10 N. Le soluzioni sono state lasciate al buio e a temperatura ambiente per 14 ore. Dopo addizione di 10 ml di esano e 7 ml di H₂O e centrifugazione di 1 ora a 900´g, è stata separata la fase esanica contenente la frazione insaponificabile. Dopo addizione di ulteriori 10 ml di esano, i campioni sono stati acidificati fino a pH 3-4 con HCl al 37%. Dopo centrifugazione di 1 ora a 900´g, è stata separata la fase esanica contenente gli acidi grassi liberi. Tale fase è stata evaporata sotto vuoto, il residuo è stato disciolto in 1 ml di CH₃CN/0.14% CH₃COOH (V/V) e aliquote di ciascun campione sono state iniettate in HPLC.

Analisi mediante HPLC a serie di diodi

La separazione degli acidi grassi insaturi è stata effettuata con un cromatografo liquido Hewlett-Packard 1050 equipaggiato di un rivelatore a serie di diodi 1040M (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA). È stata utilizzata una colonna a fase inversa Alltech Adsorbosphere C-18 (Alltech Europe, Eke, Belgium) con particelle del diametro di 5 mm, 250 x 4.6 mm, con fase mobile CH₃CN/H₂O/CH₃COOH (70/30/0.12, V/V/V) ad un flusso di 1.5 ml/min. Gli acidi grassi insaturi sono stati rivelati a 200 nm. Mediante l’iniezione di acidi grassi standard di riferimento, la costruzione di curve di calibrazione, la comparazione dei tempi di ritenzione e degli spettri di assorbimento UV, si è riusciti a stabilire il profilo quali-quantitativo in acidi grassi insaturi degli estratti microalgali. La purezza dei picchi cromatografici è stata inoltre determinata usando il programma Phoenix 3D HP Chemstation.

Analisi di specie microalgali

E’ stata effettuata la quantificazione dei lipidi totali, l’analisi della composizione quali-quantitativa in acidi grassi insaturi di 5 microalghe, ottenute con un preliminare ciclo produttivo (1^a produzione) per una prima valutazione dei ceppi naturalmente ricchi in acidi grassi insaturi  w-3. 

Sono state analizzate:

Ø      Chorella minutissima

Ø      Chlorella sp.

Ø      Isochrysis sp.

Ø      Tetraselmis suecica

Ø      Haematococcus pluvialis

Nella figura 1 è stata riportata la composizione negli specifici acidi grassi w-3 ALA, EPA e DHA, delle specie analizzate.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 La Chlorella minutissima e la Chlorella sp. si sono rivelate buone produttrici di EPA, acido grasso di notevole interesse commerciale, mentre l'Haematococcus pluvialis e, in minor misura, la Tetraselmis suecica hanno mostrato una buona produzione di ALA, acido grasso essenziale.

La Chlorella minutissima e la Chlorella sp. sono state sottoposte ad altri cicli produttivi, e di volta in volta sono stati modificati alcuni parametri operativi onde valutare quelli più idonei per una ottimizzazione della produzione di EPA.   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Nel passaggio dalla prima alla seconda produzione la modifica operativa più importante è stata l'eliminazione dell'insuflazione di CO₂, e nel caso della Chlorella minutissima l'introduzione di uno stadio finale di liofilizzazione in sostituzione della convenzionale essicazione. Nella terza produzione è stata eliminata la fonte di azoto, e per la Chlorella sp. si è introdotto il processo di liofilizzazione.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Nella figura 2 e nella figura 3 sono riportati i valori dei lipidi totali, espressi in mg/mg di alga secca, delle due specie di Chlorella.

figura 2

 

 

 

 

 

 

 

 

figura 3

 

 

 

 

 

 

 

 

Per la Chlorella minutissima la miglior resa in lipidi totali si è osservata nel campione della prima produzione e in quello della seconda produzione liofilizzato, mentre per la Chlorella sp. nel campione della terza produzione liofilizzato.

 

Nelle figure 4  e 5 è stato riportato il profilo quali-quantitativo degli acidi grassi insaturi più abbondanti, espressi in mg/mg di alga secca, delle due specie di Chlorella nelle diverse produzioni. Le due alghe hanno mostrato la stessa composizione qulitativa.

Nella Chlorella minutissima l'eliminazione dell'insuflazione di CO₂ ha determinato un significativo aumento della produzione di EPA. L'ottimizzazione della produzione di questo acido grasso si è osservata nel campione ottenuto dalla seconda produzione liofilizzato. In questo caso l'EPA si è dimostrato l'acido grasso insaturo preferenzialmente sintetizzato dalla microalga, in una quantità estremamente interessante (13.63 mg/mg alga secca).

 

 

 

 

 

 

figura 4

 

 

 

 

 

 figura 5

 

 

 

 

 

 

 

 

L'eliminazione della fonte di azoto (terza produzione) ha determinato un aumento della produzione degli acidi grassi monoinsaturi, influendo in maniera decisamente negativa sulla sintesi di EPA.
 

Anche nel caso della Chlorella sp. l'eliminazione dell'insuflazione di CO₂ ha determinato un significativo aumento della produzione di EPA. L'ottimizzazione della produzione di questo acido grasso si è osservata nel campione ottenuto dalla seconda produzione essicato. L'EPA si è dimostrato il secondo acido insaturo preferenzialmente sintetizzato dalla microalga. Le basse rese ottenute sono da imputarsi al processo finale di essicazione. Nel campione della terza produzione si è osservato un aumento della sintesi degli acidi grassi monoinsaturi (16:1 e 18:1), acidi grassi preferenzialmente prodotti dalla microalga e una diminuzione EPA. Il notevole miglioramento della resa in acidi grassi è da ricondursi all'introduzione del processo di liofilizzazione, tappa fondamentale per il recupero proficuo e mirato di tali composti.

Anche l'Haematococcus pluvialis è stato sottoposto ad altri cicli produttivi, e di volta in volta sono stati modificati i parametri operativi di coltivazione e di lavorazione della biomassa, per valutare quelli più adatti per una ottimizzazione della produzione di ALA.

 

 

 

 

 

tabella 1

 

 

 

                                              

Nella tabella 1 è stato riportato il valore dei lipidi totali e il profilo quali-quantitativo degli acidi grassi insaturi dell'Haematococcus pluvialis, che differisce sostanzialmente da quello delle due specie di Chlorella. Nel passaggio dalla prima alla terza produzione, quella ottimale, si è osservato un progressivo aumento della resa in ALA, che rappresenta l'acido grasso insaturo preferenzialmente sintetizzato dalla microalga, e presente in quantità di gran lunga superiore rispetto agli altri acidi grassi (14.33 mg/mg alga secca).

 

CONCLUSIONI

Le alghe selezionate presentano significative variazioni nel loro valore nutritivo in relazione alla composizione in acidi grassi polinsaturi della serie w-3.

Elevati tenori in EPA, che nobilitano il valore alimentare di queste microalghe, sembrano essere una caratteristica delle due specie di Chlorella, e in particolare la Chlorella minutissima può essere considerata un'ottima fonte di questo acido grasso.

Anche l'Haematococcus pluvialis si è rivelata una microalga estremamente interessante per l'elevato contenuto in ALA e in altri acidi grassi della serie w-3, che potrebbero fungere da importanti precursori metabolici di acidi grassi ad alto grado di insaturazione.

 

SOTTOPROGETTO 3

 

Realizzazione di un impianto semiautomatizzato per la coltivazione massiva di alghe unicellulari.

 

PREMESSA

La coltivazione delle alghe è diventata un’attività di grande importanza industriale per la produzione di biomasse a scopo alimentare, mangimistico e per ottenere prodotti farmaceutici e cosmetici.

Le alghe unicellulari planctoniche sono organismi fotosintetici che si riproducono con grande rapidità per scissione diretta e necessitano di terreni di coltura relativamente poveri e poco costosi e possono inoltre essere indotte a produrre particolari sostanze utili mediante opportuna selezione dei ceppi.

Le metodologie di coltura delle microalghe si distinguono principalmente in colture di laboratorio che hanno come obiettivo la ricerca di base, il mantenimento e la caratterizzazione delle specie algali più idonee all’allevamento e le colture massive che mirano a una produzione industriale e che sono ancora oggi scarsamente diffuse per gli alti costi di gestione.

Le colture massive sono costituite da popolazione algali ad elevata concentrazione, per questo le condizioni ambientali di allevamento devono essere tali da consentire un buon sviluppo dei fitoplanctonti, richiedono inoltre un costante monitoraggio delle condizioni di crescita.

Gli elevati costi di mantenimento di questi tipi di coltura, pur dando ottime rese in qualità di biomassa, limitano il loro uso al solo ottenimento di colture altamente pure, necessarie o per l’estrazione di metaboliti da utilizzare a scopi farmaceutici, o per inoculi di colture nei sistemi aperti.

L’obiettivo di questo lavoro è di ideare un modulo di produzione microalgale in grado di automatizzare le fasi di crescita e standardizzare le metodiche per una possibile applicazione a livello industriale.

In particolare è stato messo appunto un sistema di produzione semiautomatizzato, semplificato e standardizzato, atto a produrre alte concentrazioni di colture singole di microalghe in volumi discreti da poterne valutare l’utilità come integratori alimentari (produttori di acidi grassi ) o come sostanze ad azione farmacologica (attività citotossica).

 

Nel corso dell’anno sono state svolte più attività mirate alla realizzazione di un impianto (Modulo) in grado di garantire la produzione massiva di colonie monospecifiche di microalghe planctoniche prive di contaminanti esterni (batteri; protozoi etc.).

La realizzazione è avvenuta su più fasi:

1.      Progettazione dell’impianto

2.      Assemblaggio del modulo;

3.      Produzione di microalghe

4.      Recupero della biomassa algale;

 

 

 

PROGETTAZIONE DEL MODULO

Dopo aver eseguito una perlustrazione con planimetria del locale, sito nei laboratori della DepAS srl. presso Selargius, si è passati alla fase di progettazione con la realizzazione sulla carta dello schema del prototipo (Fig. 1)

Il Perspex è stato preferito hai sacchi in Polietilene (utilizzati nelle avannotterie) per la sua capacità di trasmettere la luce, circa il 92% della luce incidente, per la possibilità di un riutilizzo dei cilindri previa sterilizzazione; ed inoltre la sua struttura rigida, permette il loro riempimento graduale e l’isolamento della colonia microalgale dall’esterno, limitando quindi il rischio di inquinamento.

 L’acqua necessaria a sostenere la coltivazione è stata di volta in volta prelevata direttamente in mare mediante una pompa collegata a una cisterna da 200 L; il serbatoio di raccolta, posto sul tetto dell’edificio, consente di sfruttare la caduta a gravità. L’acqua prima di arrivare all’interno dei cilindri subisce un processo di filtrazione attraverso tre filtri a porosità decrescente 50, 10 e 0.47 µm, che garantiscono un’eliminazione graduale dei solidi organici ed inorganici sospesi e solo successivamente passa all’interno di un debatterizzatore costituito da una serie di lampade UV.

L’aria utilizzata per mantenere il mezzo di coltura in costante turbolenza è immessa nella parte bassa dei cilindri attraverso la spinta di un elettrosoffiante, anch’essa è filtrata con filtri da 0,22 µm e sterilizzata con un debatterizzatore UV, inoltre può essere arricchita, secondo le necessità, con insufflazione di CO₂.

L’illuminazione è fornita da 13 lampade fredde a basso contenuto di UV dell’intensità di 1 Klux ciascuna.

 

 

ASSEMBLAGGIO

L’impianto è stato assemblato in modo da costituire un modulo compatto in grado di poter funzionare in qualsiasi locale in cui vi sia una presa di corrente 220V ed una d’acqua (dolce e/o marina), inoltre è stato montato in modo tale che sia possibile raddoppiare la capacità, installando più cilindri di Perspex di due metri di altezza.

 

 

PRODUZIONE DI MICROALGHE

Metodiche

I metodi di coltura utilizzati sono un perfezionamento di quelli tradizionalmente adoperati nelle avannotterie mirati alla produzione di fitoplancton come alimento per lo zooplancton perciò in sintesi, con il passaggio progressivo da piccoli a grandi volumi di acque salmastre e/o dolci ultrafiltrate, sterilizzate e fertilizzate con sali, vitamine e oligoelementi (Soluzione di Walne)^3,4), sotto l’illuminazione continua (24/24h) o secondo i cicli circadiani (12/24h), con o senza insufflazione di CO₂ ad una temperatura costante per ogni produzione e compresa tra 18 e 25°C nei diversi tipi di alghe.

La metodologia di coltura applicata all’impianto è simile al ciclo semicontinuo, ossia un compromesso tra la propagazione progressiva e il ciclo continuo Questa metodica consiste nel mantenere attiva la coltura per lunghi periodi, prelevando circa il 20-30% della coltura stessa, e riportando a volume con acqua arricchita di nutrienti (inoculo). Questa tecnica ha il vantaggio, una volta avviata la produzione, di poter protrarre la coltura per lunghi periodi, annullando i tempi di attivazione, ha però lo svantaggio di essere soggetta ad inquinamenti oltre che ad invecchiamento cellulare. Questi inconvenienti sono facilmente superati grazie alle condizioni di isolamento e sterilità della monocoltura microalgale garantita dalle caratteristiche dell’impianto e da un monitoraggio giornaliero dei paramentri abiotici (pH, T°C, S‰) e biotici (densità microalgale, carica batterica), ciò ha garantito la purezza della monocoltura da contaminazioni di altre specie algali e batteriche e l’individuazione dell’invecchiamento cellulare.

 

Condizioni di crescita

 

Tutto ciò ci ha permesso di eseguire gli inoculi prima che si instaurassero i processi di decadimento cellulare in modo che le cellule algali risultino sempre in fase esponenziale di crescita, ottenendo una produzione elevata nel minore tempo possibile.

Sono, inoltre state prodotte monospecie algali in diverse condizioni di crescita allo scopo di orientare il metabolismo algale; in particolare sono state allestite produzioni con presenza o assenza dell’azoto, con o senza l’insufflazione di CO2, con salinità differenti e variando la temperatura di incubazione allo scopo di studiare l’andamento della produzione degli acidi grassi omega 3.

 

RECUPERO DELLA BIOMASSA ALGALE

Per il recupero della biomassa algale inizialmente è stato utilizzato il processo di flocculazione attivato con l’aggiunta di Idrossido di Sodio (NaOH 2N). L’utilizzo di altri flocculanti come: AlCl₃; Al₂(So₄); Ca(OH); AlCl_3. ha dato risultati negativi per tutte le alghe in studio.

In breve in un cilindro con 60 L di coltura sono stati aggiunti 250 cc di NaOH 2N, lentamente e sotto costante ed energica agitazione, la sedimentazione delle microalghe si è osservata dopo12h.

A questo punto dopo aver aspirato il surnatante in eccesso attraverso una pompa la biomassa è stata sottoposta a diversi cicli di lavaggi e sedimentazione con acqua di mare filtrata e sterilizzata fino ad ottenere un volume di 3,5 L.

La separazione totale è stata ottenuta mediante centrifugazione a 4000 RPM per 15’(Haematococcus pluvialis Chlorella minutissima, Chlorella sp., Isocrysis sp.)o a 5000 RPM per 15’ nel caso della Tetraselmis suecica.

Successivamente la biomassa è stata portata a secco mediante liofilizzazione.

La resa in peso secco ottenute per le singole colture è riportata nelle tabelle annesse ai grafici

 

OTTIMIZZAZIONE DELL’IMPIANTO

 

Nell’ultima parte del lavoro si è provveduto all’ottimizzazione delle procedure di gestione dell’impianto, puntando su più obiettivi:

 

1° ) Risparmio energetico;

2° ) Continuità di produzione;

 

RISPARMIO ENERGETICO

Nella prima parte l’impianto è stato attivato e calibrato in modo da ottenere la maggior quantità di biomassa microalgale nel minor tempo possibile. Per l’ottenimento di tale biomassa l’impianto era stato programmato in modo che la monocoltura si trovasse sotto saturazione luminosa, garantita da tredici lampade da 1klux ciascuna contemporaneamente accese per ventiquattro ore su ventiquattro.

Nella seconda parte si è sperimentato un risparmio energetico puntando sulla riduzione del numero di lampade, portate da 13 a 7, e dimezzando il tempo di esposizione.

Le produzioni che hanno fornito un risultato migliore come compromesso tra risparmio e quantità di biomassa microalgale hanno riguardato la Tetranselmis suecica che in 17 giorni ha raggiunto una densità di 25 miloni di ind./ml, e la Chlorella minutissima che in 27 giorni ha raggiunto una densità finale di 41 milioni di individui.

Il risparmio energetico ottenuto è stato del 73% rispetto al consumo necessario per le produzioni effettuate nella prima fase di sperimentazione, mentre i tempi di accrescimento sono rimasti pressoché invariati.(figura 6)

 

CONTINUITA’ DI PRODUZIONE

Ogni produzione richiede:

·        Sterilizzazione dei cilindri, i cilindri vanno tenuti 24 ore in Ipoclorito di sodio al 10% e 24 ore in Tiocianato di sodio per eliminare l’eccesso Cloro;

·        Un tempo minimo di 15 giorni di accrescimento della monocoltura microalgale, per il raggiungimento della biomassa desiderata, all’interno dell’impianto;

·        Flocculazione: al termine di ogni produzione le microalghe devono essere separate dall’acqua in cui si sono accresciute, tutta l’operazione comporta un impegno di tre giorni;

Ogni ciclo produttivo richiede quindi venti giorni (15 + 2 + 3 = 20).

Nel periodo compreso tra giugno del 2001 e giugno 2002 sono stati portati a termine 13 cicli di produzione completi che hanno prodotto 5 differenti tipologie microalgali, con più di un ciclo produttivo completo al mese.

Si può ipotizzare, che per ultimare un ciclo completo siano necessari 30 giorni e per avere una continuità di produzione e garantire un rifornimento di biomassa microalgale con cadenza settimanale siano necessari quattro impianti di produzione attivati con una sfasatura di una settima.

 

CONCLUSIONI

 

La semplicità della metodica, la sua economicità e le numerose informazioni che è capace di fornire rappresentano delle qualità che ne fanno una prova da utilizzare su larga scala nelle seguenti attività:

-         Studio delle curve di crescita di più specie microalgali

-         Produzione di elevate quantità di biomassa microalgale

-         Versatilità nelle modificazioni dei parametri di accrescimento

 Il tutto inoltre rappresenta un’ottima base di partenza per sostenere lo studio sui prodotti del metabolismo microalgale in quanto il sistema è in grado di fornire al Ricercatore quantità elevate di biomassa specifica ed axenica da cui poter estrarre i metaboliti da utilizzare per scopi farmaceutici.

 

 

 

 

FIGURA 1- Schema dell’impianto per la coltivazione di microalghe

                                                           

 

 

 

                                                                            

 

                                                                              

                                                                                                                            

 

 

 Legenda: Acciaio Zincato(         ) Perspex  (        )

 

Figura 1-Curva di crescita di Haematococcus pluvialis

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Condizioni di crescita:

 

TEMPERATURA:   20-22°C

SALINITA’:  4‰

pH:  7.5

ARIA: insufflazione energica

Illuminazione: Saturazione luminosa (13 lampade, 24/24 h)

RECUPERO BIOMASSA: Flocculazione con NaOH; Centrifugazione a 3000 RPM X 15’; Liofilizzazione.

 

Commento

 

·        Ha raggiunto dopo 19 giorni la densità di 28x10⁶ ind./ml;

·        La biomassa secca recuperata è stata di 0,159 g/L.

 

Figura 2-Curva di crescita di Chlorella minutissima

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Condizioni di crescita:

TEMPERATURA:    20-22°C

SALINITA’:  35-37‰

pH:  7.5-10 

ARIA: insufflazione energica

Illuminazione: Saturazione luminosa (13 lampade, 24/24 h)

RECUPERO BIOMASSA:  Flocculazione con NaOH; Centrifugazione a 5000 RPM X 15’; Liofilizzazione.

 

Commento

 

·        Ha raggiunto dopo 22 giorni la densità di 28x10⁶ ind./ml;

·        La biomassa secca recuperata è stata di 2,4 g/L

 

Figura 3-Curva di crescita di Chlorella sp.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Condizioni di crescita:

TEMPERATURA:    20-22°C

SALINITA’:  35-40  ‰

pH:  7.5-10 

ARIA: insufflazione energica

Illuminazione: Saturazione luminosa (13 lampade, 24/24 h)

RECUPERO BIOMASSA: Flocculazione con NaOH; Centrifugazione a 5000 RPM X 15’; Liofilizzazione.

 

Commento

 

·        Ha raggiunto dopo 18 giorni la densità di 30x10⁶  ind./ml;

·        La biomassa secca recuperata è stata di 2,3 g/L

 

 

Figura 4-Curva di crescita di Isocrysis sp

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Condizioni di crescita:

TEMPERATURA:    20-25°C

SALINITA’:  35-40‰

pH:  7.5-9.2 

ARIA: insufflazione energica

Illuminazione: Saturazione luminosa (13 lampade, 24/24 h)

RECUPERO BIOMASSA: Flocculazione con NaOH; Centrifugazione a 5000 RPM X 15’; Liofilizzazione.

 

Commento

 

·        Ha raggiunto dopo 44 giorni la densità di 60x10⁶ ind./ml;

La biomassa secca recuperata è stata di 2,7 g/L

 

Figura 5-Curva di crescita di Tetraselmis suecica

 

 

 

Condizioni di crescita:

TEMPERATURA:    20-25°C

SALINITA’:  18-20 ‰

pH:  7.5-9.0 

ARIA: insufflazione energica;

Illuminazione: Ritmo circadiano 12/24 h;

RECUPERO BIOMASSA:  Centrifugazione a 5000 RPM X 15’; Liofilizzazione.

 

Commento

 

·        Ha raggiunto dopo 22 giorni la densità di 60x10⁶ ind./ml;

·        La biomassa secca recuperata è stata di 0,5 g/L

 

 

 

 

Figura 6-Curve di crescita di Chlorella minutissima in condizioni di in saturazione luminosa ed in risparmio energetico

 

 

 

Condizioni di crescita:

TEMPERATURA:    20-25°C

SALINITA’:  35-39‰

pH:  7.5-9.2 

Illuminazione: Saturazione luminosa (13 lampade, 24/24 h);

Risparmio energetico (7 lampade 12/24 h)

 

Commento

 

·        La C. minutissima in saturazione luminosa ha raggiunto dopo 17 giorni la densità di 29x10⁶ ind./ml;

·        La C. minutissima in risparmio energetici ha raggiunto dopo 17 giorni la densità di 12x10⁶ ind./ml;

 

 

BIBLIOGRAFIA

1.      Herrero C.. Nutritional properties of four marine microalgae for albino rats. J. Appl. Phycol., 5: 573-580, 1993.

2.     Morimoto T. et. al.. Anti-tumor-promoting glyceroglycolipids from the green alga, Clorella vulgaris. Phytochemistry, 5: 1433- 1437, 1995

3.      Walne P.R.. Experiments in the large scale culture of larvae of Ostrea edulis. Great Britain Ministry of Agricolture Fisheries and Food, 53, 1996.

4.      Pane L. et. al.. Viability of the marine microalga Tetraselmis suecica grown free and immobilized in alginate beads. Aquaculture international- J. Eur. Aquacult. Soc., editor M.G. Poxton. 6: 411-420, 1998.

 

 

SOTTOPROGETTO 4:

 

Estrazione di sostanze antibiotiche da macroalghe e piante aquatiche comunemente presenti lungo le coste de Mediterraneo

 

La ricerca ha riguardato raccolta, identificazione e trattamento di macroalghe e piante acquatiche comunemente presenti lungo le coste del Mediterreneo.

Le macroalghe raccolte appartengono alla divisione Chlorophyta (Alghe verdi) con le specie Ulva sp. e Acetabularia mediterranea, e Phaeophyta (Alghe brune) con le specie Padina pavonia, Cystoseria crinita, Cystoseria spp.. Per quanto riguarda le piante acquatiche è stata oggetto di studio la più diffusa ed interessante fanerogama marina, la Posidonia oceanica (L.) Delile.

Per quanto riguarda l’estrazione dei principi attivi, in primo luogo le alghe e le piante sono state lavate in acqua sterile, ripulite dagli eventuali epifiti, asciugate e ridotte in frammenti. Per gli estratti crudi si è utilizzato il seguente protocollo: i frammenti di alghe sono stati pesati ed omogenizzati nella proporzione di 1 grammo di pianta +10 ml di metanolo/toluene (rapporto 3/1). Per quanto riguarda gli estratti lipidici, sono stati effettuati mediante omogenizzazione con una soluzione di metanolo, cloroformio e acqua rispettivamente in proporzione 2:1:1. Dischetti di carta sterile del diametro di 6 mm sono stati imbibiti con 10 microlitri degli estratti, lasciati asciugare ed utilizzati per i saggi di attività antibiotica.

L’attività degli estratti algali (Tab. 1) è stata saggiata su 24 specie di microrganismi, dei quali 6 (1 gram-positivo e 3 gram-negativi e 2 miceti) erano di provenienza clinica, 11 (2 gram-positivi e 9 gram-negativi) ambientale e sono stati anche utilizzati 7 ceppi ATCC (4 gram-positivi e 3 gram-negativi).

In questa fase della ricerca la Chlorophyta Ulva sp. è l’alga i cui estratti sembrano avere una maggiore attività antibatterica che si esprime soprattutto nei riguardi dei gram-negativi. Gli estratti crudi agiscono effettivamente su un maggior numero di specie batteriche ma sempre a concentrazioni molto alte (100 mg/ml).

Molto interessante è l’attività degli estratti lipidici, per quanto tale attività antibiotica si sia espressa solo su Aeromonas hydrophila, occorre precisare che tale attività è stata rilevata a concentrazioni comprese fra 250 e 500 microgrammi/millilitro, sia da estratti di Ulva sp. che di Padina pavonia e Cystoseria crinita, inoltre il batterio era un isolato clinico che presentava resistenza a diversi antibiotici.

Nel complesso i batteri gram-negativi si sono dimostrati molto più sensibili all’attività antibiotica espressa dagli estratti algali, mentre nessuna inibizione della crescita è stata manifestata da Candida albicans e Rodotorula rubra.

La ricerca è proseguita con lo studio della attività antibiotica espressa dagli estratti della fanerogama marina Posidonia oceanica (L) Delile.

La Posidonia oceanica è una fanerogama endemica del Mediterraneo, poiché si rinviene soltanto lungo le coste di questo bacino. Le specie “sorelle” appartenenti allo stesso genere, hanno il loro areale di distribuzione lungo le coste meridionali della Australia. Quindi il genere Posidonia ha una distribuzione bipolare, cioè con presenza di specie parte a Nord e parte a Sud dei Tropici.

La Posidonia oceanica, quale pianta supriore, è organizzata in radici, rizoma e foglie, accanto alla riproduzione vegetativa per stolonizzazione, presenta un ciclo sessuato con formazione di fiori e frutti. I fiori sono ermafroditi, raggruppati in particolari infiorescenze di colore verde, che sono portate da uno stelo inserito nel centro del ciuffo e sono avvolte per tutta la loro lunghezza da due brattee floreali. La P. oceanica può colonizzare vaste aree di fondo marino formando ampie distese chiamate praterie che si estendono da 1 a 30 m di profondità, spingendosi anche fino a 40 m in acque particolarmente limpide. Le foglie inoltre esercitano un’azione frenante sui movimenti dell’acqua, riducendo in particolar modo l’impatto delle onde con il litorale.

I prelievi di piante sono stati effettuati in periodo invernale–primaverile quando è minima la presenza di epifiti sulle foglie. Sia gli “estratti crudi” (metanolo/toluene) che gli “estratti lipidici” (metanolo/cloroformio/acqua) sono stati saggiati su 34 microrganismi, dei quali 8 gram-positivi (4 ATCC, 2 clinici, 2 ambientali), 24 gram-negativi (3 ATCC, 3 clinici, 18 ambientali) e 2 miceti (clinici) (Tab. 2).

Per quanto riguarda gli estratti crudi un minimo di attività è stata espressa a concentrazioni piuttosto alte, pari a 1,5 mg/ml, su Staphylococcus aureus ATCC 25923, Streptococcus pneumoniae ATCC 6303, Vibrio fluvialis di provenienza ambientale, Aeromonas hydrophila di provenienza clinica e Rodotorula rubra di provenienza clinica.

Risultati molto interessanti si sono ottenuti con il saggio degli estratti lipidici: si è avuto un alone di inibizione di 22 mm per Staphylococcus aureus ATCC 25923 alla concentrazione di 125 mcg/ml, un alone di 15 mm, alla stessa concentrazione, per Streptococcus pyogenes ATCC 19615; aloni di inibizione della crescita variabili tra gli 8 ed i 20 mm a concentrazione di 500 mcg/ml si sono ottenuti per Streptoccoccus gruppo D (clinico), Bacillus subtilis (ambientale), Vibrio fluvialis (ambientale), Acinetobacter spp. (ambientale), Candida albicans (clinico)

I risultati ottenuti dalla ricerca stimolano ulteriori studi ed approfondimenti riguardanti in particolare le Alghe Brune, che sono fra le macrofite quelle che si sono rivelate più interessanti.

Un interesse particolare meritano le ricerche sulla attività biologica espressa dagli estratti dei rizomi della Posidonia, in particolare occorrerà individuare e separare le singole frazioni lipidiche e valutare quali fra queste esprimano l’attività antibatterica evidenziata nel corso della nostra ricerca.

 

 

 

Tabella 2- Attività antibiotica da estratti di Posidonia oceanica
Ceppi	Estratto crudo	Estratto lipidico
	MIC (μg/ml)	MIC (μg/ml)
Staphylococcus aureus ATCC 25923	1500	125
Streptococcus pneumoniae ATCC 6303	1500	> 1000
Streptococcus pyogenes ATCC 19615	> 1500	125
Streptococcus gruppo D	> 1500	500
Bacillus subtilis	> 1500	500
Vibrio fluvialis	1500	500
Aeromonas hydrophila	1500	1000
Acinetobacter spp.	> 1500	500
Candida albicans	> 1500	500
Rodotorula rubra	1500	> 1000

MIC= minima concentrazione inibente